贾玉娇博士

贾玉娇，协和华美研发部主任。从山东大学临床医学系毕业后，保送至中国医学科学院血液病医院，在血研所国家重点实验室王建祥教授课题组攻读博士学位。毕业后进入血研所病理中心工作，她擅长技术攻坚，在协和华美成立之初带领研发团队攻坚克难，成功研发出血液病基因突变筛查套餐、出凝血疾病基因筛查、遗传病基因筛查和肿瘤靶向治疗相关基因检测等项目。

▲△此次ASH年会围绕血液病相关的最新研究内容展开，包括基础、检测和临床研究，下面我与大家分享的内容为“二代测序对疾病克隆演变的研究”。

▲△2016年ASH，仅在口头汇报里，关于克隆演变的相关研究就高达40余篇，这些研究大部分都采用基于二代测序技术的全外显子组测序（WES）和靶向深度测序相结合的方法。克隆演变涉及到的疾病包括急性髓系白血病（AML）、骨髓增生异常综合症（MDS）、再生障碍性贫血（AA）、淋巴瘤、骨髓瘤以及阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）等多种疾病类型。下面是关于AML和MDS的几篇代表性摘要。

▲△此项研究是关于正常核型的AML病人在病情的进展和复发中存在的克隆演变模式。研究针对50个正常核型的AML病人，分别在收集诊断、缓解和复发三个时间点的标本，采用WES和靶向深度测序检测方法发现了四种克隆演变的模式：

1. 稳定型（诊断和复发时基因突变一致）；

2. 稳定获得型（复发时获得新突变）；

3. 稳定缺失型（复发时丢失突变）；

4. 混合型（复发时既获得又丢失突变）。 

对诊断和复发时的基因突变和克隆模式进一步分析，结果如上图所示：

• （A图）大部分的基因突变（70%，黄色）在诊断和复发时都存在。

• （B图）四种克隆演变模式图，图中显示DNMT3A等基因突变在疾病进展过程中稳定存在，WT1、EZH2以及KDM6A等基因突变倾向在疾病复发中获得，而PTPN11和NRAS等基因突变则倾向丢失。

• （C图和D图）指不同克隆演变模式与无复发生存之间的关系，稳定缺失型（C图）或无获得型（D图）克隆模式的无复发生存率更低。

研究者对此的解释为：推测无获得型的克隆模式在诊断时就存在两种克隆，随着疾病进展和用药，敏感性的克隆被抑制杀伤，耐药克隆失去竞争对手，所以生存优势更加明显，在疾病进展过程中表现出更强烈的耐药优势，造成无复发生存率更低。这提示我们分析克隆演变的时候要注意克隆丢失的病例。

▲△此项报道对原发急性髓系白血病使用靶向深度测序进行克隆演变研究。选取40例AML病人诊断和复发时的配对标本，靶向深度测序深度设定为10000X，实际平均深度为8976X，检测30个基因的外显子区或热点区域。测序共检测到249个基因突变，平均每人3.3个，98%的病人至少携带1个基因突变。

在249个突变中，45%的突变在诊断和复发的过程中稳定存在，31%新生，24%后期丢失。通过分析诊断时细胞克隆的组成，发现有8个病人只存在1个优势克隆，26个病人存在2个亚克隆，10个病人存在3个及3个以上的亚克隆。

此研究发现了两种克隆演变的模式：

• 第一种模式是优势起始克隆在复发中持续存在，间或获得新的突变或者获得新的亚克隆；

• 第二种模式是复发时起始克隆消失了，取而代之的是新的亚克隆，这种情况可能是亚克隆之间竞争选择压力或者化疗作用造成的。

▲△此项报道是研究急性髓系白血病耐药和复发的机制，通过检测诊断和复发时基因突变谱等改变来确定突变基因对治疗的敏感和耐受情况。研究选取了53例AML配对样本，采用WES和靶向深度测序两种方法，对研究数据采取不同层面的筛选标准。

分析基因突变数据的筛选标准不同，每个人基因的突变数目也会所差异：

• 采用宽泛的数据筛选标准分析，平均每人诊断时存在4.5个基因突变，复发时有5个基因突变，两种状态中都存在的有3.5个基因突变；

• 只分析与白血病密切相关的基因突变发现，平均每个人诊断时有1.5个基因突变，复发时有2个，共存有1个基因突变。

通过对比诊断和复发两个时间点的基因突变负荷（VAF）发现，DNMT3A，IDH2，TET2基因突变通常存在于AML的优势克隆中且在治疗过程中稳定存在；WT1，GATA2，FLT3等突变在复发时VAF增加，预示与化疗耐受相关；而KRAS和NRAS的亚克隆对化疗更敏感。

▲△此报道主要研究了MDS病人在阿扎胞苷治疗反应及向AML转化过程中基因改变情况，选择95例MDS患者的285份不同时间点的标本。检测结果发现最常见的基因突变依次为ASXL1、TET2、DNMT3A、SRSF2。将突变基因划分为7个生物组，其基因突变频率最高的组为DNA甲基化。

研究将基因突变负荷和临床治疗反应以及疾病进展情况联合分析发现：

• （A图）AZA非反应组的基因突变负荷明显高于反应组。

• （C图）与其他组别相比，活化信号通路的基因突变负荷在后续复查中持续处于增长趋势。

• （D图）存在活化信号通路基因突变的病人，在AZA治疗中向AML转化的几率更高。

以上结果提示基因突变负荷与临床耐药和疾病进展密切相关。

▲△此项研究也是关于阿扎胞苷治疗MDS过程中病人体细胞突变的动态改变，研究入组38例进展期MDS病人在接受阿扎胞苷治疗前、中、后的连续样本。结果显示大部分基因突变的VAF都在1%左右，少部分大于2%。对比同一病人前后标本突变的VAF，发现 ：

1. VAF大于2%的基因突变在AZA治疗过程中处于动态改变中，而VAF~1%的突变保持较稳定。

2. 接受AZA治疗的MDS病人的基因突变是一个动态的过程，主要涉及的一些高危基因，包括TP53, RUNX1, CUX1, ASXL1 and BCOR。

这项研究对我们比较有启发的是，之前我们通常认为VAF高的突变是疾病早期发生的，VAF低的突变是后期发生的，这个研究提示我们，VAF低（~1%）的突变也可能在早期就存在了，由于其增殖优势不明显，持续处于低频突变状态中。

▲△此报道主要研究克隆动态改变在MDS疾病进展和转归过程中的作用。研究先是分析了2250例MDS已发表的测序结果，通过这个分析确定两型基因：

• 1型是包括FLT3等基因在内的7个基因，与高危的MDS相比，1型基因主要发生在继发的AML病人中；

• 2型包括GATA2在内的10个基因，与低危MDS病人相比，2型基因主要发生在高危的MDS病人中。这项研究是检测699例MDS病人，其中122例是诊断和复发时都有的连续标本。

纵向分析112例样本的两种类型基因发现：

• 含有启动突变的克隆在MDS进展过程中倾向增大。

• 与2型或其他基因相比，1型基因突变在MDS进展中倾向新发。

• 1型和2型突变分别与高危MDS向sAML转化和低危MDS向高危MDS转化相关。

通过对699例病人总生存率和无进展生存率分析发现，携带1型基因突变的病人生存率明显小于携带2型基因突变的病人，而这两者的生存率明显小于携带其他如SF3B1等基因突变的病人。

▲△通过以上关于AML和MDS 6个克隆演变的研究，可以得出一致的结论：

1. 疾病进展或药物治疗前后患者中的基因突变和克隆演变处于一个动态的过程；

2. 不同的基因或不同组别的基因其动态改变的模式有所不同；

3. 基因突变负荷或优势克隆大小改变通常与临床反应相一致。

4. 采用二代测序技术检测疾病的突变负荷和克隆演变可为疾病进展、临床预后以及治疗决策提供参考价值。